В выпаривательной чашке растворяют 1 г неподвижной фазы в 20 мл перегнанного хлороформа и в раствор вносят 10 г подготовленного твердого носителя. Содержимое перемешивают покачиванием в течение 8 - 10 мин. и чашку помещают на водяную баню с температурой 60 - 65 град. С при постоянном перемешивании до полного удаления растворителя и отсутствия запаха хлороформа.
Подготовку твердого носителя и нанесение неподвижной фазы можно
производить на ротационном испарителе.
Заполнение и кондиционирование колонок
Перед кондиционированием с помощью бюретки с дистиллированной водой или расчетным путем
2
3,14 x Д x L
Vk = ----------------
4
Незаполненные хроматографические колонки предварительно промывают раствором жидкого детергента, ополаскивают дистиллированной водой, промывают спиртом, эфиром и хлороформом, продувают воздухом и прокаливают в сушильном шкафу при 200 - 250 град. С в токе инертного газа в течение 2 часов.
Новые колонки необходимо после прокаливания установить в прибор, включить газ - носитель и проверить герметичность соединений.
Заполняют колонку "под иглу" точно измеренным количеством наполнителя (твердый носитель с нанесенной неподвижной фазой). Заполненные колонки присоединяют к блоку ввода пробы, оставляя свободным второй конец, устанавливают поток газа - носителя 24 мл/мин., проверяют герметичность и термостатируют, повышая температуру от 50 град. С до 90 град. С ступенчато - 10 град. в час. После чего устанавливают температуру 90 град. С и кондиционируют 24 часа. Только после кондиционирования отключают термостат, охлаждают до комнатной температуры и подсоединяют колонку к детектору.
Подготовленная по описанной выше методике колонка работоспособна более одного года при условии соблюдения температурного режима (не меньше 95 град. С и чистоты газа - носителя. Необходимо также избегать перегрузки колонок большим количеством исследуемой пробы (т.е. более одного см3 парогазовой фазы или 5 мкл жидкой пробы).
После кондиционирования колонки проводится проверка ее
эффективности.
Проверка эффективности колонки
Проверка эффективности колонки производится с помощью контрольных растворов этилового спирта и изопропанола. В качестве контрольных растворов (стандартов) используют 2 град./оо водные растворы этанола и 4 град./оо изопропанола. Методика приготовления растворов изложена ниже в разделе "Химические реактивы".
Во флакон из-под пенициллина, содержащий 0,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты вносят 0,5 мл раствора 4 град./оо изопропанола и 0,5 мл 2 град./оо этанола, флакон закрывают стандартной пробкой, которую фиксируют приспособлением для обжима колпачков на флаконах, например, ЮК-1. Содержимое флакона перемешивают и во флакон шприцем вводят 0,35 мл раствора нитрита натрия. Флакон энергично встряхивают (30 маятникообразных движений) и оставляют на 1 минуту. После чего из флакона шприцем путем прокола пробки отбирают 0,5 см3 парогазовой фазы, которую тотчас вводят в прибор. На хроматограмме измеряют высоту пиков и вычисляют критерий разделения по формуле:
o o
V - V
R2 R1
K = -------------, где
1b0,5 + 2b0,5
индексы 1 и 2 относятся к пикам этил- и изопропилнитратам.
Значение К должны быть в пределах 1 +/- 0,05. Если К ниже 0,9, то необходимо снизить на 5 - 8 град. температуру термостата колонок и повторить измерение.
Максимального значения эффективности колонок добиваются изменением скорости потока газа - носителя.
Эффективность колонок оценивают величинами ЧТТ (N) или ЕЭТТ (Н):
t 2
5,54 ( Rcm ) , L
N = ---- H = - ;
b0,5 N
Величина ЧТТ для колонок с ПЭГ-1500 длиной 2 м должна быть не менее 2000 (ВЭТТ = 0,1 см).
В процессе работы необходимо периодически один - два раза в месяц
проверять эффективность колонок по приведенной выше методике.
Определение метрологических характеристик
Оценка точности газохроматографических измерений проводится в
соответствии с Методическими рекомендациями "Методика по нормированию
метрологических характеристик, градуировке, проверке
хроматографических приборов универсального назначения, по оценке
точности результатов хроматографических измерений", изд. Стандартов,
М., 1978.
Методика обнаружения этанола в биологической пробе
Во флакон из-под пенициллина, содержащий 0,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты, вносят 0,5 мл исследуемой пробы. Флакон закрывают стандартной резиновой пробкой и фиксируют алюминиевым колпачком с помощью ПОК (прибор для обжима пенициллиновых флаконов).
После энергичного перемешивания во флакон шприцем вводят 0,35 мл раствора нитрита натрия. Содержимое флакона энергично встряхивают (30 маятникообразных движений) и оставляют на 1 минуту. Затем из флакона шприцем путем прокола пробки отбирают 0,5 мл парогазовой фазы, которую тотчас же вводят в прибор. С помощью секундомера измеряют время удерживания от начала выхода пика несорбирующегося компонента (воздуха) до максимума измеряемого пика. Это время удерживания вещества в колонке. При наличии в исследуемой крови алифатических спиртов на хроматограмме появляются пики соответствующих алкилнитритов.
По формулам 1, 2, 3 рассчитывают параметры удерживания:
o o
1) V = u x t удерживаемый объем V ,
Ri Ri Ri
o
V
2) Vg = Ri
---- относительное время удерживания tg
V (или объем Vg)
Rcm
t
3) tg = Ri истинный удерживаемый объем V
---- oi.
t
Rcm
По таблице 1 идентифицируют обнаруженные пики алкилнитритов.
<*>
Параметры удерживания алкилнитритов
----T------------------------------------------------------------
¦NN ¦ Наименование ¦
¦п/п¦ ¦
+---+------------------------------------------------------------+
¦1. ¦Метилнитрит 0,492 ¦
¦2. ¦Этилнитрит 0,776 ¦
¦3. ¦Изопропилнитрит 1,000 ¦
¦4. ¦Изобутилнитрит 1,776 ¦
¦5. ¦Изоамилнитрит 3,791 ¦
L---+-------------------------------------------------------------
--------------------------------
<*> При вышеуказанных параметрах хроматографирования.
Для идентификации алкилнитритов достаточно вычислить
относительное время удерживания.
Если на хроматограмме отсутствуют пики, то делают заключение об
обнаружении алфатических спиртов C - C .
1 5
Количественный анализ проводят с помощью калибровки по методу внутреннего стандарта, используя для расчета отношение высот пика этанола к пику изопропанола. Калибровочный график для количественных исследований строят ежедневно, т.к. при повторном включении прибора условия хроматографии могут изменяться. График зависимости от концентрации этанола строят по 3 - 4 точкам, используя точные растворы этилового спирта в воде.
Для построения графика используются эталонные растворы этанола в концентрации 0,4 - 2; 0 - 4,0%, которые подвергаются газохроматографическому исследованию в тех же условиях, что и исследуемые пробы. На графике на оси абсцисс откладываются значения соотношения высот пиков этилнитрита к пропилнитриту (изопропилнитриту), во избежание дробных чисел среднее значение соотношения высот пиков для каждой концентрации этанола умножают на 100. Масштаб: 1 см = 0,1. На оси ординат - соответствующие им значения концентрации эталонных растворов. Масштаб: 1 см = 0,4%.
Пробу биологической среды подготавливают к вводу в прибор следующим образом: во флакон из-под пенициллина, содержащий 0,5 мл трихлоруксусной кислоты, вносят 0,5 мл раствора изопропанола (внутренний стандарт) и 0,5 мл исследуемой пробы; флакон закрывают стандартной пробкой. Пробку фиксируют. Содержимое флакона перемешивают и во флакон шприцем вводят 0,35 мл раствора нитрита натрия. Флакон энергично встряхивают (30 маятникообразных движений) и оставляют на 1 минуту. После чего из флакона шприцем путем прокола пробки отбирают 0,5 мл парогазовой фазы, которую тотчас же вводят в прибор. Для получения достоверных результатов проводят три параллельных исследования. На хроматограмме измеряют высоту пиков.
Для расчета концентрации этилового спирта удобнее пользоваться
величиной f - фактор чувствительности, который рассчитывается по
R
формуле:
C г/л x h
h cm
SUM -------------
i=1 h
x
f = -----------------
R h
где h - число текущих измерений, величина f - постоянна для
R
данной пары веществ на каждой колонке и зависит от летучести
определяемых веществ при условиях опыта.
Концентрация этилового спирта соответственно определяется по
формуле:
h
C = f x
г/л R ----
h
cm
Для вычисления концентрации этанола в исследуемых пробах
необходимо концентрацию этанола умножить на коэффициенты пересчета:
для крови - 0,95, для мочи - 1,05.
1. Газовый хроматограф ЛХМ-8МД, ЛХМ-80, Цвет-100 и другие с
детектором по теплопроводности. Колонки - 2 м.
2. Баллоны металлические для хранения сжатых газов
(гелия или азота) ......................................... 3 шт.
3. Водоструйный насос, или вакуумный насос, или
электроотсос хирургический ............................... 1 шт.
4. Редукторы газовые ................................. 3 шт.
5. Шкаф сушильный с диапазоном температур
50 град. С - 240 град. С ................................. 1 шт.
6. Приспособление для обжима алюминиевых колпачков
К-1 ...................................................... 1 шт.
7. Секундомер ........................................ 1 шт.
8. Шприц типа "Рекорд" на 1 мл, обязательно с
силиконовым уплотнением (Chirana, ЧССР) .................. 1 шт.
9. Иглы к шприцам типа "Рекорд", например, А-04,
20-1-15 для отбора парогазовой фазы) и 0806
(для ввода) ............................................. 1 компл.
10. Шкаф вытяжной .................................... 1 шт.
11. Холодильник бытовой .............................. 1 шт.
12. Мойка для мытья лабораторной посуды
(двухсекционная) ......................................... 1 шт.
Посуда
1. Колба мерная на 1 л ............................... 50 шт.
2. Колба мерная на 100 мл ............................ 10 шт.
3. Стакан мерный на 100 мл ........................... 5 шт.
4. Склянка с притертой пробкой на 100 мл ............. 10 шт.
5. Пипетки мерные на 1, 2, 5, 10 мл со знаком
аттестации Госстандарта ................................по 100 шт.
6. Флаконы из-под пенициллина с пробками .......500 - 1000 шт.
7. Колпачки алюминиевые ........................500 - 1000 шт.
8. Колба круглодонная со шлифом N 29 на 0,5 л ........ 10 шт.
Химические реактивы (на 2000 анализов в год)
1. Целит С-22, целит 545, или хромотон, или хромосорб
с зернением 60 - 80 меш. (0,16 - 0,20 мм) ............... 25 см3
2. Полиэтиленгликоль 1500 (ПЭГ-1500) ................ 3 г
3. Серебра нитрат "хч" .............................. 3 г
4. Натрия гидрат окиси "хч" ......................... 15 г
5. Натрия сульфат безводный "хч" .................... 10 г
6. Натрия нитрит "хч" ............................... 60 г
30 г натрия нитрита в мерном стакане доводят дистиллированной
водой до 100 мл. Хранят в склянке из темного стекла в
холодильнике.
7. Трихлоруксусная кислота "чда", "хч" .............. 500 г
50 г трихлоруксусной кислоты в мерном стакане доводят
дистиллированной водой до 100 мл. Хранят в склянке из темного
стекла при комнатной температуре.
8. Аммония гидрат окиси, 25%-ный раствор ............ 25 мл
9. формальдегида 40%-ный раствор .................... 25 мл
10. Хлороформ (перегнанный) ......................... 100 мл
11. Изопропанол "осч" для ГХ ........................ 4 мл
0,4 мл изопропанола в мерной колбе доводят дистиллированной
водой до 100 мл. Хранят в склянке с притертой пробкой в
холодильнике 5 суток.
12. Едкое кали "хч" ................................. 100 мг
13. Этиловый спирт для приготовления эталонных
растворов................................................ 2 мл
Предварительно спиртометром измеряются процент (объемный) исходного алкоголя. По алкоголеметрической таблице (Государственная фармакопея СССР) объемные проценты переводятся в весовые с указанием удельного веса. Затем производится расчет необходимого количества алкоголя для приготовления 10%-ного раствора спирта.
Для получения 1000 мл 1%-ного раствора из исходного спирта, содержащего 1,9% (объемных), следует:
1) перевести по алкоголеметрической таблице объемные проценты в весовые, что будет соответствовать 93,7% с удельным весом 0,8129;
2) высчитать количество алкоголя в весовых единицах, потребное для приготовления раствора необходимой концентрации
93,7% - 100
10 - X
100 x 10
X = -------- = 10,6723 г;
93,7
3) перевести весовые единицы в объемные
10,6723
------- = 13,1286 мл.
0,8129
13,1 мл спирта переносится количественно в мерную колбу емкостью 1 л. Объем доводится дистиллированной водой до метки. Из этого раствора приготавливаются растворы спирта.
Для приготовления эталонного раствора в концентрации 0,4% пипеткой отмеривается 2 мл раствора спирта, количественно переносится в мерную колбу емкостью 50 мл и разбавляется дистиллированной водой до отметки. Для приготовления 2%-го раствора берется 10 мл 1%-ного раствора спирта, а для приготовления 4% эталонного раствора берется 20 мл 1% раствора спирта, дальнейшее разведение осуществляется как указано выше.
Эталонные растворы хранятся в склянках темного стекла с хорошо зашлифованными пробками при температуре +4 - +6 град. С. При пользовании эталонными растворами следует как можно меньше оставлять их открытыми. Перед открыванием склянки с этанолом ее необходимо тщательно встряхнуть. При соблюдении этих условий эталонные растворы могут использоваться в течение 5 - 10 дней, практически не теряя своей концентрации. По истечении этого срока приготавливаются новые эталонные растворы.
Принятые обозначения
--------T------------------------T------------------------------- ¦... вол¦ Размерность ¦ Значение ¦ +-------+------------------------+-------------------------------+ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ +-------+------------------------+-------------------------------+ ¦ ¦Aс мв.мл.мг Е-1 ¦Чувствительность ¦ ¦ ¦ ¦концентрационного детектора¦ ¦ ¦ ¦(катарометра) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦a мв.см. Е-1 ¦Чувствительность регистратора¦ ¦ ¦ ¦(самописца), (потенциометра) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦b0,5 см ¦Ширина пика на уровне 1/2 его¦ ¦ ¦ ¦высоты ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Дсм ¦Внутренний диаметр колонки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦F см. сек. Е-1 ¦Скорость движения диаграммной¦ ¦ ¦ ¦ленты ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦f ¦Фактор чувствительности ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦H ¦Высота колонки, эквивалентная¦ ¦ ¦ ¦одной теоретической тарелке¦ ¦ ¦ ¦(ВЭТТ) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦h см ¦Высота пика ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦h см ¦Высота пика внутреннего¦ ¦ ¦ cm ¦стандарта ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦h см ¦Высота пика исследуемого¦ ¦ ¦ x ¦вещества ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦У ¦Индекс удерживания ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦J ¦Поправочный коэффициент для¦ ¦ ¦ ¦учета перепада давлений на¦ ¦ ¦ ¦входе и выходе колонки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦K ¦Критерий разделения ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦L см ¦Длина колонки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦N ¦Число теоретических тарелок¦ ¦ ¦ ¦(ЧТТ) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦P ; P кПа ¦Давление на входе и выходе¦ ¦ ¦ 1 o ¦колонки (соответственно) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦t сек ¦Время удерживания ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦t сек ¦Время удерживания¦ ¦ ¦ m ¦несорбирующегося компонента¦ ¦ ¦ ¦(воздуха) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦t сек ¦Относительное время удерживания¦ ¦ ¦ g ¦ ¦ ¦ ¦t сек ¦Исправленное время удерживания¦ ¦ ¦ Ri ¦вещества ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦t сек ¦Исправленное время удерживания¦ ¦ ¦ Rcm ¦вещества - стандарта ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦U мл. сек. Е-1 ¦Скорость потока газа - носителя¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦V мл ¦Относительный удерживаемый¦ ¦ ¦ g ¦объем ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦V мл ¦Истинный удерживаемый объем¦ ¦ ¦ oi ¦вещества i ¦ ¦ ¦ o ¦ ¦ ¦ ¦V мл ¦Исправленный удерживаемый объем¦ ¦ ¦ Ri ¦вещества i ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦V мл ¦Объем колонки ¦ ¦ ¦ k ¦ ¦ ¦ ¦VR мл ¦Исправленный удерживаемый объем¦ ¦ ¦ cm ¦вещества - стандарта ¦ L-------+------------------------+--------------------------------